caki-1人肾透明细胞癌皮肤转移细胞

caki-1人肾透明细胞癌皮肤转移细胞

细胞缩写：    Caki-1细胞
    细胞名称：    Caki-1(人肾透明细胞癌皮肤转移细胞)
    详细背景：    超微结构中包含许多微绒毛，少许微丝，许多小线粒体，充分发育的高尔基休和内质网，许多脂滴和多层体，次级溶酶体，没有发现病毒颗粒。
    细胞来源：    细胞主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外著名大学建系
    "购买细胞注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，细胞了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和公司技术部沟通交流。"    P4
    包装规格：    复苏T25培养瓶(一瓶)或冻存1ml冻存管（两支）
    细胞规格：    1*10(5)/ml——1*10（6）/ml
    安全水平：    1
    细胞种属：    人
    组织来源：    肾透明细胞癌皮肤转移
    细胞形态：    上皮细胞样
    细胞特性：    贴壁
    细胞融合度：    95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
    细胞检测：    细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌
  caki-1人肾透明细胞癌皮肤转移细胞

 "细胞培养三不要：
养科研细胞是生物医学研究的基本功。有三个小经验可以和大家分享一下：
1. 不要烧瓶口。大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸/碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）
其实烧瓶口防止污染纯粹是心理安慰。不妨试一下把手指在火上晃几下，你会发现根本就不会烧疼。如果有细菌的话，这么晃两下也烧不死多少。要想烧死全部细菌，除非把瓶口和塞子烧红。我在国内从来就不烧瓶口。来美国以后发现这里更*，超净台内根本就不点酒精灯。
2. 不要频繁看细胞。对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。经常可以看到新手一天到晚都在看细胞，细胞老是长不好。老手细胞一扔好几天不管，细胞疯长。
3. 不要怕消化。在传代的时候，初学者往往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，37度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞*变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。"    详见细胞说明书
    传代方法：    建议1:2-1:3 两天换液一次
    冻存条件：    详见细胞说明书
    主要文献：    请具体查阅相关发表文章
传代细胞培养操作步骤

1、        37度水浴加热所有试剂。
2、        吸取培养培养皿内旧培养液，放置一个干净离心管内。（为稍后终止消化作准备。）
3、        用PBS清洗培养皿，弃去。
4、        向瓶内加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆盖培养瓶底为宜。（一般一个大皿1ml）
5、        2-5分钟后，轻轻震荡培养皿。使细胞从瓶壁脱离形成细胞悬液。显微镜下观察若细胞由贴壁变为悬浮就加入血清（即原培养液）终止消化。
6、        收集细胞悬液，880转/分、5分钟离心，弃去上清液。
7、        加培养液至1ml，混匀后取10ul计数细胞。
8、        根据实验要求取适量细胞留种或接种于新的培养皿或96孔板、24孔板中，再加入相应体积的培养液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。
9、        接种好的培养皿顺时针和逆时针各转三圈，使细胞排列均匀。
10、        放入暖箱中继续培养。
细胞计数步骤：
1、将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上.
2、将细胞悬液吸出少许，用台盼兰溶液对被稀释后滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。(台盼兰用于标记死亡细胞。)
3、镜下观察，计算计数板八大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝8大格细胞总数/ 8×2×10000
细胞冻存与复苏：
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
　1．冻存细胞
（1）选对数增生期细胞，在冻存前1d换液。
（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×106／m1左右密度，离心，去上清。
（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞成再悬液。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤
（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m1悬液。
（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，作好标记。
（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min时间内,下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。
标准程序：
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
　　操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。
2. 复苏细胞
（1）从罐中取出冻存管。
（2）迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10 m1培养液。
（4）低速离心(880r／min) 5 min，去上清后再用培养液洗一次。
（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。
　　冻存细胞数量要充分，密度应达到107／m1，在融后稀释20倍后，仍能保持5×105／m1数量。