​预染marker原理

预染marker原理

   在蛋白质研究的实验室里，预染蛋白marker是WesternBlot实验中的工具。那一道道彩色的条带，不仅让电泳过程变得赏心悦目，更是实验成功的重要保障。那么，预染marker原理究竟是什么？这些彩色条带是如何形成的？本文将为您深入浅出地解析。

一、预染marker是什么？

   在探讨预染marker原理之前，我们先明确它的基本定义。

   预染蛋白marker（PrestainedProteinMarker），全称预制蛋白质分子量标记，是一种用于蛋白质电泳分离和分子量测定的生物化学试剂。它是将一系列已知分子量的标准蛋白质，通过化学方法与特定的染料共价偶联后混合而成的产品。

   根据颜色设计，预染marker可分为两类：

   单色预染marker：所有条带为同一种颜色（通常为蓝色），通过某些条带加倍浓度来提示其大小

   多色预染marker：采用蓝、橙、绿等多种颜色标记，便于在实验中快速辨认特定大小的条带，彩虹色设计尤为常见

   与非预染marker相比，预染marker的特点在于：电泳过程中可以直接用肉眼观察，无需染色步骤。

二、核心原理：染料与蛋白质的共价结合

   预染marker原理的核心，在于共价偶联技术。

   化学反应的实质

   在碱性条件下，蛋白质分子上的亲核性基团（如赖氨酸的ε-氨基）能够与活性染料分子上的活性基团发生化学反应。这种反应主要有两种类型：

   亲核加成反应

   亲核取代反应

   通过这两种反应，染料分子与蛋白质形成稳定的共价键。这意味着染料被牢牢“拴"在蛋白质上，在后续的电泳、转膜过程中不会脱落。

   三种颜色的形成

   为了满足不同分子量的指示需求，生产过程中会选择不同大小的蛋白质，分别与不同颜色的活性染料反应。经过纯化、浓度调整后，再将这七种不同大小的预染蛋白质混合，最终形成具有一系列分子量梯度且带有不同颜色的彩色预染蛋白marker。

三、原理带来的三大应用价值

   理解了预染marker原理，就不难明白它为何在实验中如此有用。

   1.实时监控电泳进程

   在SDS-PAGE电泳过程中，普通的蛋白样品是无色的。而预染marker的彩色条带可以实时显示：

   蛋白质是否已进入分离胶

   不同大小的分子是否正在分开

   目标蛋白是否进入分离区域（通常位于胶的2/3处）

   如果观察到marker条带异常迁移，可以及时中断电泳，避免样品浪费。

   2.直观评估转膜效率

   这是预染marker的功能：

   转膜后直接观察：无需任何处理，直接将转印后的膜放在白色背景上，用肉眼即可观察

   快速判断：如果膜上能清晰看到转移过来的彩色marker条带，说明转膜成功；若无条带，说明转膜失败（可能是电极接反、膜未激活、缓冲液失效等原因）

   整个过程仅需10秒左右，是判断转膜成功与否的方法。

   3.大致估算蛋白分子量

   通过对比预染marker条带和待测样品条带的位置，可以对待测蛋白质的分子量进行大致估算。

   但需要注意的是：由于染料共价修饰，预染marker的迁移特性会发生某些改变，在不同缓冲条件下电泳时，其表观分子量可能存在一定偏差。因此，它不适合用于精确定量。如果需要精确的分子量测定，建议配合非预染蛋白marker一起使用。

四、两个重要的注意事项

   注意一：表观分子量

   预染marker的分子量在不同浓度凝胶或不同缓冲体系中跑出来是不一样的，这个叫表观分子量。

   在不同SDS-PAGE缓冲系统（如Bis-Tris与Tris-甘氨酸）中，由于pH值不同，会影响蛋白质所带电荷及与SDS的结合能力，进而改变其电泳迁移行为。因此，使用预染marker时，建议参考产品说明书中对应缓冲体系的表观分子量。

   注意二：染料不会自行脱落

   染料与蛋白质是共价结合的，不会从蛋白质上洗脱。如果发现Marker条带变浅，通常不是因为染料脱落，而是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一部分蛋白质从膜上洗脱。

总结

   预染marker原理的核心可以概括为：将标准蛋白与染料共价偶联，使其在电泳过程中直接可见。

   基于这一原理，预染marker能够在实验中发挥三大作用：

   监控者：实时显示电泳进程

   检验员：快速评估转膜效率

   参考尺：大致估算分子量

   虽然它在精确度上有所局限（表观分子量存在偏差），但其带来的便利性和效率提升，使其成为生命科学研究中的实验工具。理解这些原理，将帮助您更好地使用预染marker，让WesternBlot实验更加得心应手。

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